TEST CITOXICITATE IN PLACI CU 96 DE GODEURI
Titlu: |
Evaluarea potentialului citotoxic al unui element de test dupa aplicarea pe celule insamantate in placi cu 96 de godeuri – colorare cu rosu neutru |
Obiective: |
Evaluarea cantitativa a potentialului citotoxic al unui element de test solubil dupa aplicarea pe celule insamantate in placi cu 96 de godeuri. |
Sistem de testare: |
Celule de cornee de iepure – SIRC |
Planificare: |
Durata studiului: 4 zile |
Inceputul studiului: 1 saptamana dupa primirea mostrei |
|
Raportare: 2-3 saptamani dupa incheierea studiului |
|
Cantitatea de produs necesara: |
2 x 20 g |
Metodologie: |
Determinarea citotoxicitatii dupa contactul elementului de test cu celulele, prin colorarea celulelor vii cu un colorant vital (Rosu Neutru). |
Procedura: |
Z-1: • Insamantarea celulelor |
Z1: • Punerea in contact cu elementul de test |
|
• Incubare timp de 48 de ore |
|
Z3: • Prepararea solutiei colorante |
|
• Revelarea citotoxicitatii |
|
• Citire |
CITOTOXICITATE-ISO 10993-5- EXTRACT
Titlu: |
Evaluarea potentialului citotoxic al extrasului dintr-un element de test (dispozitiv medical) |
Obiectiv: |
Evaluarea cantitativa si calitativa a potentialului citotoxic al unui element testat sub forma de extract dupa aplicarea pe celule insamantate in micro-placi cu 96 de godeuri. |
Sistem de testare: |
Fibroblaste din plamani de soarece – NCTC L929 |
Planificare: |
Durata studiului: 3 zile. |
Inceperea studiului: 1 saptamana de la primirea mostrelor. |
|
Raportare: 2-3 saptamani de la incheierea studiului. |
|
Cantitatea de produs necesara: |
Se defineste in functie de tipul de element de test. |
Metodologie: |
Determinarea citotoxicitatii dupa punerea in contact a extractului dintr-un element de test si a dilutiilor acestuia cu celulele, prin colorarea celulelor vii cu un colorant vital (rosu neutru). |
Calcularea procentului de celule moarte si a viabilitatii celulelor (evaluare cantitativa) si aprecierea aspectului morfologic al celulelor (evaluare calitativa) |
|
Procedura: |
Z-1: • Insamantarea celulelor |
• Prepararea extractului |
|
Z1: • Punerea in contact a extractului si dilutiilor acestuia cu celulele |
|
• Incubare timp de 24/72 de ore |
|
Z2: • Prepararea solutiei colorante |
|
• Prepararea solutiei revelatoare |
|
• Revelarea citotoxicitatii |
CITOTOXICITATE- ISO 10993 – 5 – CONTACT DIRECT
Titlu: |
Evaluarea potentialului citotoxic al unui element de test (dispozitiv medical) dupa contact direct |
Obiective: |
Evaluarea cantitativa si calitativa a potentialului citotoxic al unui element de test dupa contactul direct cu celule insamantate in placi cu 6 godeuri. |
Sistem de testare: |
Fibroblaste din plamani de soarece – NCTC L929. |
Planificare: |
Durata studiului: 3 zile. |
Inceperea studiului: 1 saptamana de la primirea mostrelor. |
|
Raportare: 2-3 saptamani de la incheierea studiului. |
|
Cantitatea de produs necesara: |
Se defineste in functie de tipul de dispozitiv medical. |
Metodologie: |
Determinarea citotoxicitatii dupa contactul direct al elementului de test cu celulele, prin colorarea celulelor vii cu un colorant vital (rosu neutru). |
Calcularea procentului de celule moarte si a viabilitatii celulelor (evaluare cantitativa) si aprecierea aspectului morfologic al celulelor (evaluare calitativa). |
|
Procedura: |
Z-1: • Insamantarea celulelor |
Z1: • Producerea contactului cu elementul de test |
|
• Incubare timp de 24 de ore |
|
Z2: • Prepararea solutiei colorante si a solutiei revelatoare |
|
• Revelarea citotoxicitatii |
|
• Citire |
CITOTOXICITATE – ISO 10993 -5 – CONTACT INDIRECT
Titlu: |
Evaluarea potentialului citotoxic al unui element de test (dispozitiv medical) dupa contact indirect |
Obiective: |
Evaluarea cantitativa si calitativa a potentialului citotoxic a unui element de test dupa contactul indirect cu suprafata unui gel de agaroza in contact cu celulele. |
Sistem de testare: |
Fibroblaste din plamani de soarece – NCTC L929. |
Planificare: |
Durata studiului: 3 zile. |
Inceperea studiului: 1 saptamana de la primirea mostrelor. |
|
Raportare: 2-3 saptamani de la incheierea studiului. |
|
Cantitatea de produs necesara: |
Se va defini in functie de tipul de dispozitiv medical. |
Metodologie: |
Determinarea citotoxicitatii dupa contactul unui element de test cu suprafata gelului de agaroza in contact cu celulele, prin colorarea celulelor vii cu un colorant vital (rosu neutru). |
Calcularea intervalului de dimensiuni al diametrului de liza a celulelor (evaluare cantitativa) si aprecierea aspectului termografic al celulelor (evaluare calitativa). |
|
Procedura: |
Z-1: • Insamantarea celulelor |
Z1: • Prepararea gelului de agaroza |
|
• Punerea in contact a gelului de agaroza cu celulele |
|
• Punerea in contact cu elementul de test |
|
• Incubare timp de 24 de ore |
|
Z2: • Prepararea solutiei colorante |
|
• Revelarea citotoxicitatii |
|
• Citirea |
AGAROZA
Titlu: |
Evaluarea potentialului iritant al unui element de test prin determinarea citotoxicitatii dupa difuzie pe gel de agaroza |
Obiective: |
Evaluarea cantitativa a citotoxicitatii unui element de test. |
Sistem de testare: |
Fibroblaste din plamani de soarece – NCTC L 929. |
Planificare: |
Durata studiuluil: 3 zile |
Inceputul studiului: 1 saptamana de la primirea mostrei. |
|
Raportare: 2-3 saptamani de la incheierea studiuluil. |
|
Cantitatea de produs necesara: |
2 x 20 g |
Metodologie: |
Determinarea citotoxicitatii prin aprecierea diametrului mediu al ariei de liza a celulelor, revelat prin colorarea celulelor cu un colorant vital MTT dupa aplicarea timp de 24h a elementului de test pe o suprafata cu gel de agaroza in contact cu celulele. |
Procedura: |
Z-1: • Insamantarea celulelor |
Z1 : • Prepararea gelului de agaroza si a elementului de test |
|
• Punerea in contact a gelului cu celulele |
|
• Aplicarea elementului de test |
|
Z2 : • Revelarea citotoxicitatii |
|
• Citirea |
NRR
Titlu: |
Evaluarea potentialului iritant al unui element de test prin aplicare directa pe fibroblaste de cornee de iepure prin metoda eliberarii de rosu neutru |
Obiective: |
Evaluarea cantitativa a citotoxicitatii unui element de test. |
Sistem de testare: |
Fibroblaste de cornee de iepure – SIRC. |
Planificare: |
Durata studiului: 2 zile |
Inceputul studiului: 1 saptamana de la primirea mostrei |
|
Raportare: 2-3 saptamani de la incheierea studiului |
|
Cantitatea de produs necesara: |
2 x 20 g |
Metodologie: |
Determinarea citotoxicitatii dupa contactul elementului de test cu un mono-strat de celule marcat cu un colorant vital (Neutral Red). Determinarea IC50. |
Procedura: |
Z-1: • Insamantarea celulelor |
D1: • Colorarea celulelor |
|
• Contact cu dilutiile elementului de test |
|
• Revelarea citotoxicitatii |
|
• Citire |
RBC
Titlu: |
Evaluarea potentialului iritant al unui element de test prin determinarea puterii sale hemolitice si denaturante impotriva proteinelor (Test de sange RBC) |
Obiective: |
Evaluarea potentialului iritant al unui element de test cu caracter tensio-activ. |
Sistem de testare: |
Celule rosii provenite din sangele ovinelor. |
Planificare: |
Durata studiului: 1 zi |
Inceputul studiului: 3 saptamani dupa primirea mostrei |
|
Raportare: 2-3 saptamani dupa incheierea studiului |
|
Cantitatea de produs necesara: |
2 x 20 g |
Metodologie: |
Determinarea cantitatii eliberate de hemoglobina (oxyhemoglobina) si proteine denaturate in supernatant prin spectrofotometrie (VISIONliteTM software). |
Calcularea concentratiei in elementul de testare, prin inducerea a 50% din liza celulara (H50). |
|
Calcularea indicelui de denaturare (DI) comparat cu denaturarea observata in cazul solutiei de sodium dodecil sulfat. |
|
Calcularea raportului H50/DI si conectarea cu potentialul iritant al ochiului al elementului de testare, in conformitate cu o scara de notare stabilita. |
|
Procedura: |
|
• Test hemoliza: |
|
– contactul elementului de test cu celulele rosii din sange |
|
– dozarea hemoglobinei eliberate |
|
• Testarea denaturarii proteinelor: |
|
– dozarea proteinelor denaturate |
HET CAM
Titlu: |
Evaluarea potentialului iritant al unui element de test dupa aplicarea pe membrana corioalantoica a embrionului din oul de gaina. |
Obiective: |
Evaluarea semi-cantitativa a potentialului iritant al unui element de test. |
Sistem de testare: |
Oua embrionare de gaini albe rasa Leghorn. |
Planificare: |
Durata studiului: 1 zi |
Inceputul studiului: 1 saptamana de la primirea mostrei |
|
Raportare: 2-3 saptamani de la incheierea studiului |
|
Cantitatea de produs necesara: |
2 x 20 g |
Metodologie: |
Observarea efectelor iritante (hiperhemie, hemoragie si coagulare) ce pot aparea dupa aplicarea elementului de test pe membrana corioalantoica a embrionului din oul de gaina (CAM) in a 10-a zi de incubatie. |
Procedura: |
Prepararea oualor si a elementului de test |
Aplicarea elementului de test |
|
Citiri |
BCOP
Titlu: |
Evaluarea potentialului iritant a unui element de test dupa aplicarea pe cornee izolata de vitel |
Obiective: |
Evaluarea semi-cantitativa a potentialului iritant a unui element de test. |
Sistem de testare: |
Cornee de vitel. |
Planificare: |
Durata studiului: 2 zile. |
Inceperea studiului: 1 saptamana de la primirea mostrelor. |
|
Raportare: 2-3 saptamani de la incheierea studiului. |
|
Cantitatea de produs necesara: |
2 x 30 g |
Metodologie: |
Masurarea opacitatii si permeabilitatii la fluoresceina a corneei de vitel dupa contactul cu elementul de test, o singura data sau de mai multe ori. |
Procedura: |
Montarea corneelor inainte de incubare. |
Masurarea opacitatii la T0. |
|
Punerea in contact cu elementul de test (2). |
|
Masurarea opacitatii dupa contact. |
|
Masurarea permeabilitatii. |
|
Evaluarea impactului asupra corneei. |
SKIN IRRITATION
Titlu: |
Evaluarea potentialului iritant a unui element de test dupa aplicarea pe EPISKIN(TM) model de epiderma reconstituita – OECD 439 |
Obiective: |
Evaluarea canitativa a capacitatii unui element de test de a produce o scadere a viabilitatii celulei care penetreaza stratum corneum dupa contactul timp de 15 minute cu epiderma reconstituita. |
Sistem de testare: |
EPISKINTM cu stratum corneum din keratinocite umane (3 unitati de epiderma) |
Planificare: |
Durata studiului: 4 zile |
Inceperea studiului: 4 saptamani de la primirea mostrelor. |
|
Raportare: 2-3 saptamani de la incheierea studiului. |
|
Cantitatea de produs necesara: |
2 x 20 g |
Metodologie: |
Evaluarea procentajului viabilitatii celulei prin colorarea celulei vii cu un colorant vital (MTT). Masurarea activitatii mitocondriale si citirea densitatilor optice. |
Procedura: |
Pentru fiecare lot de epiderma reconstituita: |
D-1: • Controlul si depozitarea sistemului de testare dupa primire |
|
D1: • Prepararea epidermei reconstituita |
|
• Contactul cu elementul de test (15 minute) |
|
• Incubare timp de 42 ore |
|
D3: • Revelarea citotoxicitatii |
|
• Incubare timp de 3 ore |
|
• Citire |
SKIN CORROSION
Titlu: |
Evaluarea coroziunii pielii dupa aplicarea unui element de test pe model de epiderma reconstituita – OECD 431 |
Obiective: |
Evaluarea canitativa a capacitatii unui element de test de a produce o scadere a viabilitatii celulei care penetreaza stratum corneum prin difuzie sau eroziune dupa diferite momente de la contact. |
Sistem de testare: |
EPISKINTM cu stratum corneum din keratinocite umane (3 loturi – 1/saptamana) |
Planificare: |
Durata studiului: 3 saptamani |
Inceperea studiului: 4 saptamani de la primirea mostrelor. |
|
Raportare: 2-3 saptamani de la incheierea studiului. |
|
Cantitatea de produs necesara: |
2 x 20 g |
Metodologie: |
Evaluarea procentajului viabilitatii celulei prin colorarea celulei vii cu un colorant vital (MTT). Masurarea activitatii mitocondriale si citirea densitatilor optice. |
Procedura: |
Pentru fiecare lot de epiderma reconstituita: |
D-1: • Controlul si depozitarea sistemului de testare dupa primire |
|
D1: • Prepararea epidermei reconstituita (1/timp de contact) |
|
• Contactul cu elementul de test (3 minute – 1 ora – 4 ore) |
|
• Clatirea sistemului de testare |
|
• Revelarea of the citotoxicitatii |
|
D2: • Citire |
FOTO – CITOTOXICITATE
Titlu: |
Evaluarea potentialului fototoxic al unui element de test solubil – Test fototoxicitate In-vitro 3T3 NRU – OECD 432 |
Obiective: |
Evaluarea cantitativa a potentialului fototoxic al unui element de test solubil dupa expunerea la UV. |
Sistem de testare: |
Fibroblaste de soarece de laborator 3T3, clona A31 |
Planificare: |
Durata studiului: 3 zile |
Inceperea studiului: 1 saptamana de la primirea mostrelor |
|
Raportare: 2-3 saptamani de la incheierea studiului |
|
Cantitatea de produs necesara: |
2 x 20 g |
Metodologie: |
Compararea citotoxicitatii unui element de test cand acesta este testat in prezenta si absenta expunerii (Sol 500 – Dr Hönle) la o doza non-citotoxica de lumina solara simulata. Determinarea viabilitatii celulare prin colorare cu vopsea vitala (rosu netru) si aprecierea factorului de fotoiritare si efectului mediu al luminii. |
Procedura: |
Z-1: • Insamantarea celulelor |
Z1: • Contactul dilutiilor elementului de test (8) cu celulele |
|
• expunere la UV |
|
Z2: • Prepararea solutiei colorante si a solutiei revelatoare |
|
• Revelarea citotoxicitatii |
|
• Citirea |
BCOP – OECD 437
Titlu: |
Metoda de testare a opacitatii si permeabilitatii corneei de bovine pentru identificarea produselor corozive oculare si extrem de iritante – OECD 437 |
Obiective: |
Identificarea produselor corozive si foarte iritante pentru ochi (clasa R41). |
Sistem de testare: |
Cornee de vitel. |
Planificare: |
Durata studiului: 1 zi. |
Inceperea studiului: 1 saptamana de la primirea mostrei. |
|
Raportare: 2-3 saptamani de la incheierea studiului. |
|
Cantitatea de produs necesara: |
2 x 30 g |
Metodologie: |
Masurarea opacitatii si permeabilitatii la fluoresceina a corneei de vitel dupa contactul cu elementul de test in conditii experimentale definite in functie de natura organoleptica a produsului. |
Procedura: |
Instalarea corneelor inainte de incubare. |
Masurarea opacitatii la T0. |
|
Punerea in contact cu elementul de test. |
|
Masurarea opacitatii dupa contact. |
|
Masurarea permeabilitatii. |
|
Evaluarea impactului asupra corneei. |